本生资讯| ELISA试剂盒实验常见问题及解决方法

　　对于ELISA试剂盒实验新手来说，实验中遇到的一些棘手的问题便无从下手，天津本生小编列出了ELISA试剂盒实验中一些常见的问题以及解决方法，希望对您有所帮助：

　　问题序号可能原因解决方法显色淡，灵敏度偏低

　　1 试剂盒未充分平衡试剂盒从2～8℃冰箱取出后打开盒盖，于室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温(约25℃)

　　2 样品不适合做ELISA检测样品一般选择培养上清、血清、血浆。其他样品形式可能不适合做ELISA检测或者需要优化检测的条件(例如稀释液的成分)

　　3 酶标板在贮存或洗后拍干时过分干燥防止板过于干燥

　　4 包被抗体遭到破坏操作温和，移液枪不能碰到孔底

　　5 样本和抗体孵育条件不合适按照说明书条件，建议孵育过程中全程振荡孵育。

　　6 洗涤浸泡时间过长按照说明书操作。勿人为增加浸泡时间;

　　7 偶联HRP试剂污染弃去试剂，重新配置

　　8 错误的稀释偶联HRP试剂弃去试剂，重新配置

　　9 TMB底物孵育时间过短，因非人为因素影响，需要优化孵育时间确定合适的孵育时间：人为判定-浓度的标准品出现深蓝色;S4-5有淡蓝色;机器判定620 nm波长下测定OD值达到0.6-0.65

　　10 样本浓度过高或存在基质效应建议做不同稀释倍数，确认样本合适的稀释倍数。

　　11 酶标仪滤光片设置有问题或者波长选择不对确认仪器设置及选择正确的波长检测。

　　12 酶标板不适合做ELISA不能使用细胞培养板，建议使用ELISA用高吸附力板子。

　　背景深，全部呈有色(通常的Elisa背景值OD<0.2)

　　1 洗涤不充分，洗后未拍干，样品中其它成分残留或酶标记物残留洗液准确配制;充分洗涤，静置15，拍干。加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染。

　　2 底物污染，未避光保存，出现颜色弃去底物，重新配置

　　3 样品稀释液污染弃去稀释液，重新配置

　　4 吸头重复使用，未洗净或消毒不吸头尽可能一次性使用

　　5 不正确的孵育时间，温度(尤其是底物孵育的时间)为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。按照说明书要求。

　　6 偶联抗体(streptavidin-HRP)浓度过高按照说明书调整到合适的浓度

　　7 ELISA板子不正确的贮存酶标板贮存于2-8 ℃;使用结合力低点的Elisa板8 没有正确封闭在标准品稀释液中加入动物蛋白或延长封闭时间

　　9 样本溶血严重建议使用非溶血或轻微溶血样本，严重溶血样本会导致背景偏高。

　　重复性不佳，高CV值

　　1 样品不均一加样充分混匀样品，取样确保移液位置一致;

　　2 包被板表面遭到破坏洗板加样时尽量小心，避免破坏板的包被表面

　　3 孔与孔之间的交叉污染孵育后取下盖子小心操作，避免孔与孔的污染;封板膜不能重复使用

　　4 加样量不一致样品稀释应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴

　　5 边缘效应(外周孔显色较中心孔深)孵育时尽量100 rpm旋转混匀

　　6 微量加样不准确微量加样的准确性和均一性

　　7 不正确的洗涤洗液准确配制;充分洗涤，静置15，确定每一步的洗涤出现白板

　　阳性对照不显色

　　1 显色液变质更换新的显色液

　　2 洗涤液配制有误请按说明书所示稀释倍数配制3 未加酶结合物而认为已加入注意不要漏加

　　4 终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用每次加液均应看清标签

　　5 标准品稀释方法错误/或标准品有问题请按照说明书所示配置说明书，注意单位和稀释倍数

　　6 不同试剂盒或不同批号的试剂混用建议使用同批次试剂盒。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。

　　不正常的标准曲线

　　1 错误的方法重悬标准品 加入正确量的溶液重悬标准品，重悬充分

　　2 标准品稀释错误 按照说明书要求稀释标准品

　　3 标准品污染 使用一次性的灭菌吸头，标准品贮存于2-8 ℃

　　4 错误的倍比稀释步骤 按照说明书倍比稀释标准品

　　5 波长选择错误TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而 者比色波长为450nm，后者为492nm。双波长比色分析优于单波长。

　　6 标准品混用 不同批号试剂勿混用

　　7 试剂盒在运输途中时间太长，温度太高，标准品失活 尽量缩短运输时间，夏季应放冰块降温

　　8 ELISA未终止而直接检测450nm和620nmTMB显色需终止后检测，否则会出现620nm比450nm读数高的现象。

　　(数值仍有梯度规律)样品或标准品OD超出正常范围

　　1 错误的样品或标准品的稀释 按照说明书稀释2 偶联抗体浓度过高 按照说明书调整到合适的浓度3 TMB底物孵育时间过长 调整到合适的孵育时间4 样品或标准品污染 避免污染5 错误的孵育时间或温度 按照说明书6 孵育时未加盖导致溶液挥发和污染 贴封片或加盖标曲很好，但是样本无法计算到数值1 标曲选择不合适选择合适的标曲拟合;

　　2 样本含量很低，低于灵敏度无法被检测到尝试浓缩样本或使用高敏ELISA试剂盒检测3样本含量很高，超过标曲建议进行预实验摸索稀释倍数，确保样本OD值落在标曲范围内标曲高浓度间无明显趋势1如OD绝对值靠谱，但是仅无梯度，则显色过度TMB显色体系中建议根据S1，S2颜色进行判断，当S1，S2深蓝色，有明显梯度，S5有淡蓝色时即可终止。2仅作单波长检测。由于参考波长读取非特异性检测，如指纹、划痕、水渍等，对结果也有影响。建议终结果以双波长为准确。兔ELISA试剂盒

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